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2014年11月29日 星期六

第二節 讓人著迷的氫氣

(《生命科學》是國內生命科學領域最大的科普雜誌。本文應此雜誌主編邀請撰寫,並發表於2009年第5期。2009年初,有關氫氣生物學研究剛剛開始起步的,當時國際上相關學術論文只有30篇,筆者發表的論文當時只有6篇,在該領域才剛剛開始嶄露頭角。該雜誌主編慧眼識珠,很早就開始關注到這一領域,說明該雜誌的眼光獨到。)

自然界有一種物質,最為簡單,而分布最為廣泛,占據宇宙物質組成的90%左右,這種物質就是氫。有人認為,對於高等生命來講,吸入氧氣,呼出二氧化碳,與氫何干?現在這種看法未免有些偏頗。別忘了,自然不行無用之舉,既然氫無處不在,肯定就有它存在的價值。隨著科學研究的逐漸深入,我們漸漸發現氫氣對生命具有巨大的貢獻。原來氫是如此讓人著迷。


一、潛水中的氫
承受著海水的巨大壓力,感受絕對安靜的無聲世界,潛入海中,和魚蝦做一次親密接觸吧。雖然美妙迷人的海底世界能讓我們暫時忘記一切,但費力的呼吸動作和寂靜背景下的呼吸聲音會給我們留下深刻印象。
潛入水下時,人們需要呼吸與周圍環境壓同樣的高壓氣體,因此深度越大,所呼吸的氣體壓力越高。潛水時最常用最方便的高壓氣體是壓縮空氣。不過,人們很早就發現,達到60~100m水下時,呼吸壓縮空氣會遇到一個無法克服的障礙。因為空氣的主要組成成分是氮氣,而高壓氮氣可以使人發生氮麻醉。對潛水員來講,這顯然非常危險,因此國際上一般都規定呼吸壓縮空氣潛水的最大深度不能超過60m。
那麼我們肯定希望超過60m,該怎麼辦呢?人們自然已經想到一個最簡單方法,就是換用麻醉作用小的其他氣體替代氮,其中最常用的是氦和氫。比如說,國際上最大的潛水深度記錄701m就是採用呼吸氫、氦和氧混合氣的方法實現的。
隨著一門新興的應用性邊緣學科──潛水醫學(又稱水下醫學,是研究和解決潛水作業過程中各種醫學問題的一門學科)的興起,氫也受到了更多科研人員的關注。


二、初露頭角的氫
使用氫作為呼吸氣體的重要前提是,人們認為氫與氦一樣,屬於生理學惰性氣體,就是說這種氣體被人體呼吸後,不與體內任何物質發生反應。常識告訴我們,氫氣本身具有還原性,因此,早期仍有少數人認為,氫氣在生物體內具有抗氧化作用。1975年,有人曾在《科學》發表論文證明,連續呼吸8個大氣壓97.5%氫氣(2.5%氧)14天,可有效治療動物皮膚惡性黑色素肝瘤,並認為療效是通過抗氧化作用來實現的。2001年,法國潛水醫學家證明,呼吸8個大氣壓高壓氫氣可治療肝曼森血吸蟲感染引起的炎症反應,首次證明氫氣具有抗炎作用,並提出氫氣與羥自由基(活性氧的一種,能殺死細菌等病原微生物),也能破壞DNA、細胞膜和多糖化合物等,給人體造成直接傷害)直接反應是治療炎症損傷的基礎。但上述研究並沒有引起廣泛注意,一方面可能是因為高壓氫難以作為一般臨床治療手段,另一方面是有人曾採用同位素標記的方法沒有獲得呼吸氫氣與體內物質發生反應的直接證據。


三、大顯身手的氫
2007年7月,日本醫科大學太田成男教授在《自然醫學》中報導,動物呼吸2%的氫氣就能有效清除自由基,顯著改善腦缺血再灌注損傷(缺血性腦血管病的一種,是威脅人類生命健康的一種主要疾病),基礎就是氫氣在體內的選擇性抗氧化作用。該研究成果迅速引起廣泛關注,並掀起研究氫氣治療疾病的熱潮。日本醫科大學甚至專門建立了氫分子醫學研究中心,我們的許多研究正是在他們的思路啟發下開展的。
隨後,該研究組又用肝和心肌缺血(心臟的血液灌注減少,導致心臟的供氧減少,心肌能量代謝不正常,不能支持心臟正常工作的一種病理狀態)動物模型,證明呼吸2%的氫氣可治療肝和心肌缺血再灌注損傷。美國匹斯堡大學移植中心對氫氣在器官移植方面非常關注,他們證明,呼吸2%的氫氣可治療小腸移植引起的炎症損傷,對小腸缺血和心臟移植後損傷同樣具有保護作用。四川華西醫院麻醉科發現,呼吸2%的氫氣可治療腎缺血再灌注損傷。我們通過大量動物實驗證明,呼吸2%氫氣可治療新生兒腦缺血缺氧損傷,研究結果與日本學者的結果類似。
上述研究表明,作為一種選擇性抗氧化物質,氫氣對很多疾病具有治療作用,具有十分廣泛的應用前景,也徹底推翻了氫氣屬於生理學惰性氣體的傳統觀點,並啟動一個新的研究方向:氫分子醫學。


四、改頭換面的氫
一些人提到氫氣未免會感到害怕。的確,關於氫氣球爆炸致人傷殘的報導也偶見報端,歷史上最著名氫氣球爆炸要屬德國的興登堡氣球爆炸空難。即使氫氣是治療某些疾病最好的良藥,可是畢竟排除不了在氣體混合過程中存在爆炸的危險,而且需要比較特殊的設備,操作比較複雜。這就給研究人員出了一道難題,怎麼才能把氫氣安全有效地送到人體呢?因此,他們開始尋找更加實用的給藥方法。
要知道呼吸氫氣治療疾病的本質是氫氣首先溶解在血液中,如果把氫氣先溶解在水中飲用會怎麼樣呢?好像主意不錯。
2008年7月,日本醫科大學學者發現,給動物喝一段時間氫氣水後,可以抑制應激引起的記憶力下降,增加神經幹細胞數量,這項研究成果在美國《神經精神藥理學》雜誌上發表,是有關氫氣水的首次報導。隨後,他們又發現,飽和氫氣水可以治療多種疾病,如人類2型糖尿病、小鼠基因缺陷引起的動脈硬化、維生素C缺乏引起的神經損傷、化療藥順鉑引起的腎損傷和帕金森病等。
正是在這種思路的啟發下,我們製造出飽和氫氣生理鹽水,並與國內外30多家科研單位合作進行廣泛深入研究。通過注射氫氣溶液的方法給藥以後證明,氫氣生理鹽水對新生兒腦缺血缺氧損傷具有一定的治療作用。我們還發現,早期治療可明顯改善新生兒神經功能和學習記憶能力。該注射液對小腸缺血再灌注損傷、小腸缺血再灌注後引起的肺損傷,對心肌、肝和腎缺血再灌注損傷和吸菸引起的肺損傷等也均有治療作用。更加不可思議的是,我們發現,中樞少量注射飽和氫氣注射液具有一定鎮痛作用。
現在日本學者已經把溶解氫的水,類似汽水使之走上市場。據了解,國內有上海鴻儒科技發展有限公司等多家單位已經開發出中國自己的含氫飲用水產品。可以預見,將來會有越來越多的氫氣產品被開發出來,小小氫分子將廣泛造福於人類健康。


五、抗氧化衰老的氫
氫氣的生物學作用主要是抗氧化作用,為什麼它會有如此功效呢?我們要先從自由基開始說起。
自由基是維持正常生命所必需的物質,同時也是生物大分子、細胞的危險殺手。所以正常生理情況下,體內自由基不斷產生,也不斷被清除,使之維持在一個正常生理水平上。可以想像,自由基過多或過少對機體均是有害的。生物體內自由基類型有很多,其中研究比較多的氧自由基和過氧化氫一起被稱為活性氧。發生缺血或炎症時,體內會大量產生各類活性氧,在這些活性氧中,羥自由基和過氧亞硝基陰離子毒性強,能直接導致細胞氧化損傷。過去的研究思路是尋找足夠強的還原性物質,但是必然導致機體氧化還原狀態的失衡,甚至還導致抗氧化治療無效。因此,尋找可選性中和羥自由基和過氧亞硝基陰離子的物質,是治療各類氧化損傷的有效方法,是抗氧化應該選擇的正確思路之一。
氫氣具有選擇性、無毒、無殘留、價格便宜等諸多優點,是否就是一個理想的選擇性抗氧化物質,需要更多研究來支持。自由基是衰老、炎症、缺血等常見疾病的重要介質,氫氣作為選擇性抗氧化物質,能否在將來走向臨床,對人類與衰老和疾病的戰鬥中發揮重要作用,非常值得期待。


六、由來已久的氫
在生物進化的歷史上,氫曾經發揮過非常重要的作用。在生命的最初階段,厭氧細菌(在無氧條件下生活的細菌)依靠氫來對抗氧自由基的損傷。那麼在人這樣的高級生物裡還有沒有內源的氫呢?
最近的研究證明,實際上,人和動物體內有很多氫氣,這些氫氣的來源是大腸內的細菌分解產物,被血液吸收後運送到身體各部分。2002年有《科學》文章證明,小鼠體內氫氣的水平,在肝臟等組織達到50umol以上,而日本學者的實驗證明,25umol就能保護細胞抗氧化損傷。因此,體內的氫氣水平足夠產生抗氧化的能力。當然當機體發生嚴重的氧化損傷時,這種保護作用不能完全發揮,特別是在血液循環發生障礙,局部氫氣水平也受到影響,從而產生一定傷害。這也許就是為什麼補充氫氣能治療這些疾病的原因。
正常人終末呼吸氣氫氣水平為(5~10)×10-6,乳糖不耐受和菌群紊亂等疾病患者呼吸氣中氫氣水平可明顯增加到(1~2)×10-4,臨床上可通過檢測呼吸氣中的氫氣水平用來診斷上述疾病。
總之,氫氣具有選擇性抗氧化作用的發現,具有里程碑的意義,它不僅會引起基礎和臨床醫學領域的很大興趣,而且可能對人類疾病的防治產生深遠影響。一個大膽的推想是,如果氫氣確實能在臨床上發揮重要作用,這項研究有望向鼎醫學生理學諾貝爾獎。但由於目前研究的深度和廣度限制,筆者很難給出更加清晰的描述和展望。我們將不斷關注和總結該領域的更新和發展,也希望有更多人對氫分子醫學引起關注。

第三節 氫分子醫學研究進展

(本文寫成於2010年,初稿由筆者指導的幾名博士研究生完成,在筆者修改後發表在《第二軍醫大學學報》。2008年筆者曾發表在該雜誌上一篇英文觀點類文章,提出氫氣是一種內源性抗氧化物質。由於英文不方便國內讀者閱讀,本書沒有選用。)



氫分子醫學研究進展


摘要:過去人們對氫的生物學效應認識存在誤解。最近的研究發現,氫是一種良好的選擇性抗氧化物質,對許多疾病具有治疾作用。本文就最近有關研究進展進行綜述,並提出幾個可能的研究方向。


前言
氫是自然界最簡單的元素,氫氣是無色、無臭、無味、具有一定還原性的雙原子氣體。氫元素占宇宙物質組成的90%左右,可以說是宇宙的最基本化學元素。與氧和氮等類似,氫的溶解度比較低,但氧可與血紅蛋白結合,能夠順利通過呼吸被機體大量吸收,而氫和氮則不能被大量吸收,人們一直沒有重視氫在高等生物體內的作用。在輻射化學領域,曾有人證明在溶液中氫氣可與羥自由基直接反應[1],但這沒有受到生物學家重視。在潛水醫學領域,氫氧混合氣潛水過程存在呼吸數十個大氣壓高壓氫的情況,因氣體在液體中溶解量隨分壓增加而增加,科學家曾試圖證明高壓情況下,氫氣或許可與氧在溶解狀態下反應,或與高活性自由基發生反應,但研究並沒有獲得該反應存在的直接證據[2]。因此,過去大部分生物學家一直認為,氫氣屬於生理學惰性氣體。最近的研究發現,氫氣不僅不是生理學惰性氣體,而且是一種非常理想的抗氧化物質,並啟動一個新的研究方向:氫分子醫學。


氫分子醫學研究進展
早期有少數人認為,氫氣在生物體內具有抗氧化作用。1975年,曾有人在《科學》發表論文證明,連續呼吸8個大氣壓97.5%氫氣(2.5%氧)14天。高壓氫氣可有效治療動物皮膚惡性腫瘤,並認為是通過抗氧化作用[3]。2001年,法國潛水醫學家證明,呼吸8個大氣壓高壓氫氣可治療肝曼森血吸蟲感染引起的炎症反應,首次證明氫氣具有抗炎作用,並提出氫氣與羥自由基直接反應是治療炎症損傷的基礎[4]。但上述研究並沒有引起廣泛注意主要原因可能是高壓氫難以作為一般臨床治療手段。2007年7月,有人在《自然醫學》報導,動物呼吸2%的氫氣就可有效清除自由基,顯著改變腦缺血再灌注損傷,他們採用化學反應、細胞學等手段證明,氫氣溶解在液體中可選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子,然後兩者是氧化損傷的最重要介質,目前體內尚未找到內源性特異性清除途徑。因此認為,氫氣治療腦缺血再灌注損傷的基礎是選擇性抗氧化作用[5]。該研究迅速引起廣泛關注[6-8],並引起了研究氫氣治療疾病的熱潮。隨後,有人又用肝和心肌缺血動物模型,證明呼吸2%的氫氣可治療肝和心肌缺血再灌注損傷[9,10]。採用飲用飽和氫氣水可治療應激引起的神經損傷、人類2型糖尿病、小鼠基因缺陷慢性氧化應激損傷、化療藥順鉑引起的腎損傷和帕金森病[11-16]。呼吸2%的氫氣可治療小腸移植引起的炎症損傷[17],對小腸缺血和心臟移植後損傷同樣具有保護作用(會議資料)。四川華西醫院麻醉科發現,呼吸2%的氫氣可治療腎缺血再灌注損傷(會議資料)。我們也證明,呼吸2%的氫氣可治療新生兒腦缺血缺氧損傷[18]。上述研究表明,作為一種選擇性抗氧化物質,氫氣對很多疾病具有治疾作用,具有十分廣泛的應用前景,也推翻了氫氣屬於生理學惰性氣體的觀點。
呼吸一定濃度的氫氣可治療腦缺血再灌注損傷,但是,通過呼吸的方法不僅在氣體混合過程中存在爆炸的危險,而且需要比較特殊的設備,操作比較複雜,在臨床上難以推廣。因此,尋找更加實用的給藥方法也是需要探討的問題。我們課題組經過理論推算,發現如果將純氫在生理鹽水中溶解,經過一定的處理,使其達到飽和溶解,可制造出氫的生理鹽水飽和溶液,這樣就可通過注射氫溶液的方法給藥。目前我們已經制備出這種溶液,採用腹腔或靜脈注射飽和氫鹽水,證明該注射液對新生兒腦缺血缺氧損傷後行為學、腦梗死體積和組織損傷程度均有明顯改善作用,特別是早期治療可明顯改善新生兒腦缺血缺氧損傷2月後神經功能和學習記憶能力[19]。另外,該注射液對小腸缺血再灌注損傷[20]、小腸缺血再灌注後引起的肺損傷[21]、心肌、肝和腎(未發表)也均有治療作用。因此,注射含氫生理鹽水是一種簡便而且有效的給氫途徑。
氫的生物抗氧化作用有非常鮮明的優點。首先,氫的還原性比較弱,只與活性強和毒性強的活性氧反應,不與具有重要信號作用的活性氧反應,這是氫選擇性抗氧化的基礎。其次,潛水醫學的長期研究表明,人即使呼吸高壓氫也無明顯不良影響[22]。再次,氫本身結構簡單,與自由基反應的產物也簡單,例如與羥自由基反應生成水,多餘的氫可通過呼吸排出體外,不會有任何殘留,這明顯不同於其他抗氧化物質,如維生素C與自由基反應後生成對機體不利的代謝產物(氧化型維生C),這些產物仍需要機體繼續代謝清除。最後,氫氣的制備容易,價格低廉。因此,作為一種抗氧化物質,氫氣具有選擇性、無毒、無殘留、價格便宜等諸多優點,具有很強的臨床應用前景。


氫氣與選擇性抗氧化
自由基是含有未成對電子的原子、原子團或分子。自由基是維持正常生命所必需的物質,自由基反應是能量代謝的基礎,部分自由基是細胞內重要信號分子,自由基也是生物大分子、細胞的危險殺手[23]。生理情況下,體內自由基不斷產生,也不斷被清除,使之維持在一個正常生理水平上,自由基過多或過少均會給機體造成不利影響甚至傷害。生物體內自由基類型有很多,例如半醌類、氧、碳和氮自由基等,其中研究比較多的是氧自由基和氮自由基。氧自由基包括超氧陰離子、單線態氧和羥自由基。因過氧化氫等在生物學作用上與氧自由基類似,常把氧自由基和過氧化氫等共稱為活性氧。比較重要的氮自由基有一氧化氮和過氧亞硝基陰離子。發生缺血或炎症時,體內會大量產生各類活性氧,在這些活性氧中,過氧化氫和一氧化氮等具有非常重要的信號作用,毒性作用很弱,而羥自由基和過氧亞硝基陰離子毒性強,是導致細胞氧化損傷的主要介質[24-25]。過去針對氧化損傷治療的研究思路是尋找足夠強的還原性物質,還原性太強,必然導致內源性氧化還原狀態的失衡,甚至是導致抗氧化治療無效的關鍵原因。因此,尋找可選擇性中和羥自由基和過氧亞硝基陰離子的物質,是治療各類氧化損傷的有效方法,是抗氧化應該選擇的正確思路之一。
目前,人們在尋找選擇性抗氧化物質的研究方面的進展仍然比較慢,比較明確的選擇性抗氧化物質比較少。而氫氣是否就是一個理想的選擇性抗氧化物質,也需要更多時間來支持。


展望
1.氫氣治療疾病的機制

關於氫氣治療疾病的機制,有兩個方面需要深入研究,一個是氫的選擇性抗氧化,由於氫的還原作用並不十分強,在一定溫度條件下氣態的氫可與氧發生反應,生物體內不存在這樣的溫度條件,因此不與氧直接發生反應。儘管氫不與氧化作用弱的活性氧直接反應,但是氫可與氧化作用很強的活性氧,如羥自由基和亞硝酸陰離子直接發生反應[5]。雖然離體實驗證據提示氫具有選擇性抗氧化作用,但明顯缺乏在體的直接證據,因此,在體是否也具有選擇性抗氧化作用,需要深入探討。另一個是信號機制,從目前的資料看,氫可與羥自由基和亞硝酸陰離子直接發生反應,其中羥自由基活性強,因為羥自由基活性比較強,其本身選擇性應該不會太好,可以與多種還原性物質發生反應,雖然氫只能與這樣活性分子反應,不能直接推論為氫可以選擇性中和它,這個觀點也有學者提出來,是從反應速度上看,羥自由基的反應速度是與氫反應的1000倍,除非氫濃度特別高,否則不應該有選擇性[6]。那麼羥自由基的衍生產物如果也能與氫發生反應可能更有說服力,當然亞硝酸陰離子可能選擇性更好一些,因為它本身活性相對較弱,更容易與氫發生反應。另外亞硝酸陰離子能調節多種信號系統,這些信號系統是否間接受到氫的影響,值得深入探討。


2.氫氣可治療疾病的範圍

關於氫氣治療疾病的範圍,顯然值得廣泛研究,由於氧化應激是多種疾病的共同發病機制,所有涉及氧化應激的疾病都有可能具有治療作用,例如各類缺血、炎症、慢性疲痛、藥物毒性作用等。由於研究的方法都比較成熟,這方面將是目前發展最為迅速的研究方向。


3.關於內源性氫氣的作用

人類和高等動物體內也存在一定水平的氫氣,目前認為,這些氫氣不是機體自身組織產生,而是來自大腸細菌代謝被人體吸收。有人曾測定正常小鼠體內不同器官氫氣水平,結果發現,小鼠大腸、脾、肝、胃黏膜等部位氫氣水平非常高,例如在肝臟可達到42umol/L,大腸和脾的水平更高[26]。十分巧合的是,採用PC12細胞氧化損傷模型研究表明,只要培養基內氫氣濃度達到25 umol/L(水中最大可溶解600umol/L,脂肪最大可溶解1200umol/L),就可顯示出明顯的抗氧化作用[5]。這說明,在正常小鼠肝臟等腹腔器官,內源性氫氣已經明顯超過抗氧化所需要的水平。正常人終末呼吸氣氫氣水平(5~10)×10-6,乳糖不耐受和菌群紊亂等疾病患者呼吸氣中氫氣水平可明顯增加到(1.0~2.0)×10-4,臨床上可通過檢測呼吸氣中的氫氣水平用來診斷上述疾病[27]。氫氣的體在抗氧化作用的發現,提示我們需要重新評價人體內氫氣的生物學效應[8]。
總之,氫氣具有選擇性抗氧化作用的發現,具有十分重要的意義,不僅會引起基礎和臨床醫學領域的很大興趣,而且可能對人類疾病的防治產生深遠影響。但由於研究的深度和廣度限制,很難給出更加清昕的描述和展望。我們將不斷關注和總結該領域的更新和發展,也希望有更多人關注氫分子醫學。


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第一節 氫分子生物學領域的經典文獻

一個學科或領域,發展歷史往往就是由幾個關鍵發現組成。在現代科學發展歷史上,偉大的發現大部分是用重要文獻或論文的形式呈現在世人面前。重要的文獻不等於引用率高,不等於國際頂級雜誌,也不等於華麗的語言描述和漂亮的圖表呈現。重要的科學發現多是存在於同行心目中的,可以經受起歷史考驗的,真正對一個學科領域的發展具有核心貢獻的文獻。
氫分子生物學仍是一個不夠成熟的領域,許多研究可能存在不全面甚至完全錯誤的可能。因此現在很難確定那些論文屬於關鍵發現,但隨時梳理、回顧和匯總過去的文獻,不僅利於對這個學科的總體發展有所了解,而且也容易對將來這個領域需要解決的問題清楚把握。本章首先簡介該領域的幾篇經典文獻,然後就本人在不同階段所寫的幾篇關於氫分子生物學的科普文章按照時間順序進行介紹。


第一節  氫分子生物學領域的經典文獻


一、高壓氧治療惡性腫瘤
這是目前發現最早關於氫氣抗氧化的文獻報導。更令人稱奇的是,這一研究早在1975年發表在國際著名雜誌《科學》上,研究內容竟然是利用高壓氫氣的抗氧化作用來治療皮膚鱗狀細胞癌。這一文獻發表後就被埋沒,主要原因是採用的研究技術需要使用潛水醫學設備,而且具有非常大的操作難度。其實關於把高壓氫氣作為一種治療疾病的手段,到目前仍沒有太多證據。因此,這一研究項目顯然具有非常強的前瞻性。在腫瘤治療面臨許多困難的現在仍具有參考價值和深入研究的必要。當然對氫分子生物學來說,目前大家都把眼光放在容易實現的小劑量-效應機制在應用的研究上。
Dole M, Wilson F R,Fife W P.Hyperbaric hydrogen therapy:a possible treatment for cancel[J].Science,1975,190(4210):152-154.


二、氫氣選擇性抗氧化
本文屬於氫分子生物學領域的開山文獻,從事該方向的學者必須全文反覆閱讀該文獻。2007年7月,日本醫科大學學者在《自然醫學》報導,動物呼吸2%的氫氣就可有效清除自由基,顯著改善腦缺血再灌注損傷,他們採用化學反應、細胞學等手段證明,氫氣溶解在液體中可選擇中和羥自由基和亞硝酸陰離子,而後兩者是氧化損傷的最重要介質,目前體內尚未找到內源性特異性清除途徑。因此研究者認為,氫氣治療腦缺血再灌注損傷的基礎是選擇性抗氧化作用。日本學者的研究迅速引起廣泛關注(已被引用300餘次)並引起了研究氫氣治療疾病的熱潮(目前國際上已發表290篇相關研究論著),日本醫科大學老年病研究所在日本著名氫氣水製造藍水星公司資助下,專門建立了氫分子生物學研究室。隨後,該研究組又用肝和心肌缺血動物模型,證明呼吸2%的氫氣可治療肝和心肌缺血再灌注損傷。採用飲用飽和氫氣水通過消化道吸收氫氣的方法,也發現可治療應激引起的神經損傷、人類2型糖尿病、小鼠基因缺陷慢性氧化應激損傷和化療藥順鉑引起的腎損傷。美國匹斯堡大學國際著名的器官移植中心的研究證明,呼吸2%的氫氣可治療小腸移植引起的炎症損傷,對小腸缺血和心臟移植後損傷同樣具有保護作用。我們課題組也證明,呼吸2%的氫氣可治療新生兒腦缺血缺氧損傷。而通過注射氫氣生理鹽水的方法,我們和國內多家單位合作,先後證明氫氣對阿爾茨海默病、急性胰線炎,膽管阻塞後肝損傷、動脈硬化、糖尿病、視網膜病變、心臟體外保存、腦和脊髓創傷等多種損傷和疾病中的治療作用。這些研究說明,作為一種選擇性抗氧化物質,氫氣對很多疾病具有治療作用,具有十分廣泛的應用前景,也徹底推翻了氫氣屬於生理性惰性氣體的觀點。
該論文有許多研究內容並沒有在正文中呈現,但這些研究內容仍非常有價值。因此為全面了解該文獻的價值和意義,對附件的內容也應該全面閱讀。關於該文獻,需要注意一些問題。
首先是細胞學研究,作者採用螢光方法研究超氧陰離子和過氧化氫的水平,結果發現都出現了一定程度的下降,雖然沒有統計學意義,但是需要注意的是,氫氣可能引起這些物質的改變,沒有統計學差異可能是因為檢測手段不夠精確。如果可以進行活體連續檢測,結果就可能完全不同。當細胞受到損傷時,損傷本身也會影響檢測結果,因為細胞損傷後自由基也出現改變,而這種因為損傷導致的改變需要認真分析,到底是如何影響,程度如何。利用幾個細胞來檢測,可能存在靈敏度不足問題。自由基測定如果有細胞內空間分布的檢測方法,可能可獲得更重要的信息,也將更有意義。關於自由基的信號問題,本人認為,以鈣離子的情況來分析,是否自由基也存在這樣的可能,正常自由基的水平也是一種動態的改變,存在振蕩波,如果能把這個紀錄下來,將是一個非常有意思的現象。氫氣雖然不能影響其振蕩頻率,可能會影響振蕩幅度,會影響高峰時刻引起的損傷性改變。
其次,氫氣對正常動物生理功能的影響,少數動物某些生理指標出現改變,這需要引起關注。最後,為證明氫氣在體內被應用,本研究採用動靜脈血液氫氣水平檢測,這個方法並不準確,即使氫氣不被組織消耗,也會出現文章中同樣結果。因為氫氣具有單向擴散的可能,當氫氣經過組織擴散到淋巴或者直接經過頭皮擴散到空氣都是會發生的。證明氫氣可以被組織利用的方法應是比較缺血與非缺血兩種情況,看是否存在不同改變。如果氫氣的消耗是因為中和自由基,缺血組動物靜脈血氫氣的濃度下降將更明顯。
Obsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxiz oxygen radicals [J]. Nat Med,2007,13(6):688-694.


三、氫氣抗炎症作用
日本的論文發表後,肯定引起了研究者所在實驗室的關注。巧合的是,另一課題組負責人也是一個日本學者Nakao,在國際上率先發表了氫氣治療器官移植的研究論文。美國匹斯堡大學器官移植中心在國際上最著名的是關於各類器官移植的試驗和應用研究。該實驗室過去一直是用呼吸一氧化碳研究其抗氧化的,當看到氫氣的研究,自然很容易開展這樣的工作。因為他們不僅有思路上的延續性,而且具備技術條件。該研究證明,呼吸2%的氫氣可治療小腸移植引起的炎症損傷。這也正是該研究最重要的發現,就是首次清楚證明了氫氣具有抗炎症的效應。當然,抗氧化和抗炎症本身存在緊密聯繫,甚至有人認為活性氧就是一類炎性因子,抗活性氧本身就可以抗炎症。儘管如此,從實驗證據角度,這是首先獲得氫氣具有抗炎症的證據。
Buchholz B M, Kaczorowski D J, Sugimoto R, et al. Hydrogen inhalation ameliorates oxidative stress in transplantation induced intesinal graft injury[J]. Am J Transplant,2008,8(10):2015-2024.


四、氫氣通過誘導肝臟成纖維細胞生長因子(FGF)21促進能量代謝治療肥胖
這個文獻屬於經典文獻的原因有三個,一是來自首先發現氫分子生物學效應的日本醫科大學;二是首先發現肝臟FGF21可以受到氫氣的影響;三是發現氫氣具有減肥效果。
日本醫科大學太田成男教授小組2007年在國際上首先證明氫氣通過選擇性抗氧化治療腦卒中,所在實驗室是日本醫科大學老年病研究所,過去主要從事線粒體與氧化損傷方面的研究,研究的疾病主要包括腦血管疾病、代謝性疾病、神經退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等。最近幾年他們圍繞氫氣對上述疾病的治療,開展了大量非常深入的系統研究。
本研究發現氫氣具有減肥作用,是非常吸引人的研究課題,2年前他們發現這個效應後,就已經申請了氫氣具有減肥作用的國際專利。
本研究發表在國際著名《肥胖》雜誌上,研究內容非常豐富。首先他們研究發現氫氣水可以促進肝臟糖原的聚集,初步可以解釋為什麼短時間給氫氣對許多疾病具有很強的治療效果。然後用缺乏瘦素受體的db/db小鼠,證明氫氣可以治療2型糖尿病,對正常高脂飲食引起動物脂肪肝也具有顯著治療效果。長期飲用氫氣水可以在不減少飲食飲水量的條件下降低動物體質量,減少體脂肪,也就是說具有減肥作用。同時動物的血糖、胰島素和三酰甘油都顯著下降,這些效果與限制飲食的效果類似。為了研究氫氣為什麼具有這些令人驚奇的減肥效果,他們採用PCR技術,發現氫氣能提高肝臟的一種重要激素──FGF21的表達水平。FGF21的作用是促進脂肪酸和葡萄糖的利用,他們採用氧消耗對氫氣促進代謝的效應進行了驗證。研究提示,氫氣可能對治療糖尿病、代謝綜合症和肥胖具有潛在的價值。這個研究也再次深化了氫分子生物學效應的分子機制,對解釋為什麼氫氣能治療動脈硬化、腦卒中和神經退行性疾病有重要參考價值。
文章中有一個非常意外的研究結果,他們用水、糖原和葡萄糖溶液分別制備含氫氣溶液,結果發現,氫氣在這三種溶液中的穩定性不一樣,釋放特別緩慢的是糖原溶液,他們的結論是:“Thus,it is concluded that H2 can be accumulated and reserved in the liver with glycogen,suggesting thatexpenditure of glycogen should accompany the release of H2.”這個推論近乎荒唐,實際上氫氣在各類大分子溶液中的釋放速度都必然降低,而且任何氣體都符合這個規律,用這個非常明確的物理學規律去解釋病理生理學校應,不知道是如何被審稿專家放行的。
Kamimura N, Nishimaki K, Ohsawa I, et al. Molecular hydrogen improves obesity and diabetes by inducing hepatic FGF21 and stimulating energy metabolism in db/db mice[J]. Obesity,2011,19(7):1396-1403.


五、氫氣生理鹽水
2008年,我們剛開展氫氣治療疾病的研究時面臨著兩個問題,一是希望證明氫氣的生物學效應是否真的存在,另一個是給動物呼吸混合氣體的制備。由於我們沒有相關設備,只能請上海標準氣體研究所協助,但由於呼吸混合氣需要消耗大量氣體,給實驗帶來了許多不便。當證明氫氣的生物學效應存在時,我們開始考慮如何更簡便地給動物氫氣,經過多次討論,最終選擇制備飽和氫氣生理鹽水。由於經驗不足,剛開始我們制備的氫氣飽和生理鹽水效果只能保持一周時間。後來經過改進,實現了可以長期保存氫氣溶液的技術,給後來的合作研究奠定了重要基礎。可以這麼說,這一研究的成功將氫分子生物學研究規模至少推動了30%。儘管研究內容並不複雜,也沒有什麼重要的新發現,許多內容都是重複呼吸氫氣同樣的研究。但這一研究成功解決了氫氣生理鹽水的制備方面,可以作為這一領域的典型論文。
Cai J, Kang Z, Liu K, et al. Neuroprotective effects of hydrogen saline in neonatal hypoxia-ischemia rat model[J]. Brain Res,2009,1256:129-137.


六、內源性氣的作用
關於內源性氫氣治療疾病比較充分的理由來自美國哈佛大學波士頓兒童醫院的研究。該研究主要是分析大腸內細菌產生的氫氣是否具有肝臟保護作用。研究者採用刀豆素A誘導的肝臟損傷模型,刀豆素A是從刀豆種子中提取的一種外源性植物血凝集素,可結合吡喃葡萄糖苷、吡喃甘露糖苷和呋喃果糖苷。這些都是細胞膜糖蛋白共有的成分,所以可結合糖蛋白。由於注射刀豆素A可以誘導肝臟組織炎症和細胞壞死,經常作為肝炎的化學誘導模型。研究包含三個方面的內容,首先是確定正常大腸細菌是否具有保護肝臟損傷的作用。實驗動物年齡為8~10雄性(C57BL/6J)小鼠,首先讓動物連續3天隨意飲用含磺胺甲噁唑8 g/L和甲氧苄氨嘧啶1.6g/L兩種抗菌藥物的水,然後連續2天飲用無抗菌藥物的水,第6天腹腔注射刀豆素A誘導肝炎。氫氣檢測結果發現動物各類組織中氫氣濃度均顯著下降,而肝功能在刀豆素A注射15mg/kg後2小時就開始出現明顯下降,而正常動物10小時後才出現明顯下降。這一研究結果提示,正常動物大腸菌群產生的氫氣對肝臟具有保護作用。第二項研究首先讓動物連續3天隨意飲用含磺胺甲噁唑4g/L、甲氧苄氨嘧啶0.8g/L和氨苄西林0.1g/L三種抗菌藥物的水,然後連續2天隨意飲用含氨苄西林0.1g/L的水,第6天刀豆素A 15mg/kg注射前12小時和注射後3小時分別給動物口服飽和氫氣水1ml罐胃。結果發現,口服飽和氫氣水可使動物肝臟組織炎症因子腫瘤壞死因子和干擾素於刀豆素注射後2和6小時顯著下降,而肝臟功能在刀豆素注射後6小時比對照組顯著改善。研究結果表明,在阻斷內源性氫氣產生的條件下,外源性氫氣對刀豆素A誘導的肝臟損傷後炎症反應和肝功能下降有明顯的治療作用。第三項研究是通過構建可以產生氫氣的細菌,觀察給動物補充產生氫氣大腸細菌是否可以對抗刀豆素A誘導的肝臟損傷。研究者首先讓動物連續3天隨意飲用含磺胺甲噁唑4g/L、甲氧苄氨嘧啶0.8g/L和氨苄西林0.1g/L三種抗菌藥物的水,然後連續2天隨意飲用含氨苄西林0.1g/L和基因工程改造可以產生氫氣或對照細菌的水。結果發現口服基因工程改造可以產生氫氣細菌的動物可以產生氫氣,並可以對抗刀豆素A誘導的肝臟損傷,對照細菌沒有保護作用。結果表明,通過補充可產生氫氣的細菌可以重新恢復因抗菌藥物造成的內源性細菌產生氫氣的不足失去的肝臟損傷保護效應。這一項研究非常全面地證明了來自大腸細菌產生氫氣的生物學效應。
Kajiya M, Sato K,Silva M J, et al. Hydrogen from intestinal bacteria is protective for Concanavalin A-induced hepatitis[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,386(2):316-321.

第一節 氣相色譜法

氫分子生物學研究首先是生物學研究,和其他生物學研究的手段沒有區別,氫分子生物學本身區別於其他研究的關鍵內容是氫氣濃度的檢測,因為氫氣的濃度檢測對分析氫氣在體內運行規律,氫氣在身體內的分布特點以及氫氣的劑量-效應關係等都是十分必要的研究內容。用於檢測氫氣的手段有許多,其中最經典的是氣相色譜檢測技術,最方便的是氫氣電極檢測技術,而最簡單的是氧化滴定技術。
氣相色譜技術可以定量分析微量甚至痕量的氫氣。氫氣電極檢測技術可以測量的範圍非常大,即可以檢測微量的氫氣,例如組織中的氫氣,也可以檢測溶液中濃度比較高的氫氣,更重要的是這種方法可以進行連續在體檢測,對研究氫氣的劑量-效應具有其他方法無法取代的地位。氧化滴定技術本身的敏感性和選擇性都比較差,而且受到檢測樣本的氧氣或各類氧化還原性物質的影響,更多地用於氫氣水產品的定性鑒定。另外,採用質譜法可以檢測極低濃度的氫氣,一般情況下氫分子生物學效應研究中很少採用。
本章對這些技術進行簡單介紹,關於具體的操作需要根據具體試驗要求,結合特殊的儀器操作程序進行檢測。



第一節  氣相色譜法


氣相色譜法測定氫氣的濃度在氫分子生物學研究中廣泛採用,可以對氫氣溶液中氫氣或血液中氫氣的濃度進行檢測, 例如2007年的第一篇氫分子生物學論文都曾經採用這種方法,最近有學者用這種方法檢測了人呼吸氫氣後血液中氫氣的濃度變化規律(圖8-1)。
氣相色譜法是用氣體作為移動相的色譜法。常用來分析高純氣體中的雜質及工業生產中的低濃度氣體。根據所用固定相的不同可分為兩類:固定相是固體的,稱為氣固色譜法;固定相是液體的則稱為氣液色譜法。按色分離原理來分,氣相色譜法亦可分為吸附色譜和分配色譜兩類,在氣固色譜中,固定相為吸附劑,氣固色譜屬於吸附色譜,氣液色譜屬於分配色譜。


圖8-1 人呼吸1%~4%氫氣前後血液氫氣濃度(umol/L)的變化
(圖片來自Ono et al. Med Gas Res. 2012,2:22)


按色譜操作形式來分,氣相色譜屬於柱色譜,根據所使用的色譜柱粗細不同,可分為一般填充柱和毛細管柱兩類。一般填充註是將固定相裝在一根玻璃或金屬的管中,管內徑為2~6 mm。毛細管柱則又可分為空心毛細管柱和填充毛細管柱兩種。空心毛細管柱是將固定液直接塗在內徑只有0.1~0.5 mm的玻璃或金屬毛細管的內壁上,填充毛細管柱是近幾年才發展起來的,它是將某些多孔性固體顆粒裝入厚壁玻管中,然後加熱拉制成毛細管,一般內徑為0.25~0.5 mm。在實際工作中,氣相色譜法是以氣液色潛為主。
氣相色譜技術所用的儀器為氣相色譜儀。除另有規定外,載氣為氮氣。色譜柱為填充柱或毛細管柱,填充柱的材質為不銹鋼或玻璃,載體用直徑為0.25~0.18、0.18~0.15或0.15~0.125 mm經酸洗並硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球。常用玻璃或彈性石英毛細管柱的內徑為0.20或0.32 mm。這樣口溫度應高於柱溫30~50℃,這樣量一般不超過數微升,柱徑越細進樣量應減少。
氣相色譜系統由盛在管柱內的吸附劑或惰性固體上塗著液體的固定相和不氣相色譜法斷通過管柱的氣體的流動相組成。將欲分離、分析的樣品從管柱一端加入後,由於固定相對樣品中各組分吸附或溶解能力不同,即各組分在固定相和流動相之間的分配系數有差別,當組分在兩相中反覆多次進行分配並隨移動相向前移動時,各組分沿管柱運動的速度就不同,分配系數小的組分被固定相滯留的時間短,能較快地從色譜柱末端流出。以各組分類柱末端流出的濃度c對進樣後的時間t作圖,得到的圖稱為色譜圖。從色譜圖可分析各組分在進樣後至其最大濃度流出色譜柱時所需的保留時間,與組分通過色譜柱空間的時間,及組分在柱中被滯留的調整保留時間的關係。
從柱後流出的色譜峰不是矩形,而是一條近似高斯分布的曲線,這是由於組分在色譜柱中移動時,存在著渦流擴散、縱向擴散和傳質阻力等因素,因而造成區域擴張。在色譜柱內固定相有兩種存放方式,一種是柱內盛放顆粒狀吸附劑,或盛放塗敷有固定液的惰性固體顆粒;另一種是把固定液塗敷或化學交聯於毛細管柱的內壁。用前一種方法制備的色譜柱稱為填充色譜柱,另一種方法制備的色譜柱稱為毛細管色譜柱。
經過分離的樣品中目標組分檢測到色譜峰信號進行積分,根據和標準品進行比對和計算出相應成分的濃度。氫分子生物學除呼吸氫氣濃度檢測外,一般都是對溶液或生物樣品中的氫氣濃度進行檢測。氣相色譜技術在本質上是屬於組分分離技術,對氫氣的檢測,可以採用頂空瓶加熱釋放的方法將氫氣從溶液中釋放出來進行檢測。而不同的檢測方法,對氫氣的濃度分辨率存在巨大的差別。例如採用普通的熱導檢測技術,只能檢測到數個10-6量級的體積分數,這顯然無法檢測只有1.0×10-8以上生物樣品中的氫氣體積分數。檢測生物樣品中氫氣的積體分數,例如血液中氫氣的體積分數,一般都是10×10-9以上體積分數,其檢測難度則比較大。
Takao等將氣相色譜分離技術與原子吸收光譜的高靈敏度性能結合起來,制作了氫氣分析儀。他們將氖氣作為載氣,經過淨化器除去雜質氣體後與樣品氣體在控制閥箱內形成混合氣體,然後進入分離柱,分離柱處在充滿液氮(溫度為-196℃)的密閉容器中,樣品氣體中含有的一氧化碳、氧氣等氣體由於沸點高於-196℃而被從混合氣體中分離出來,經除雜後的氫氣被送入原子吸收痕量還原檢測器(TRD),在此氫氣還原氧化汞發生化學反應,產生水和汞蒸氣。通過原子吸收方法檢測汞蒸氣就可以得到相應的氫氣含量。應用該方法可檢測到的氫氣最低體積分數為5×10-9。該方法是一種非常靈敏的氫氣檢測技術,巧妙地應用氧化汞與氫的化學反應,對產生的汞蒸氣進行原子吸收光譜法檢測。但是該方法分離雜質所要求的極低溫度卻不易獲得,目前只限於實驗室研究,難以滿足普通現場氫氣檢測的要求。

第二節 氫氣傳感器檢測方法

目前用電極測定氫氣濃度使用最多的是測定組織或血液中氫氣的濃度。丹麥的Unisense公司氫氣電極滿足可以一般研究的需要。常用的檢測步驟為,首先用標準氫氣溶液的不同濃度對電極進行定標,並計算出標準曲線,然後將電極刺入待測定組織或樣本中,根據測定的信號強度對比標準氫氣溶液的標準曲線計算所測定樣本中的絕對濃度(圖8-2)。



圖8-2:氫氣電極使用情況


氫氣傳感器檢測氫氣的濃度,特別是液體或生物組織中氫氣的濃度具有很大的優點。根據工作原理的不同,氫氣傳感器分電化學、半導體、熱電和光纖型等四種類型。金屬氧化物半導體傳感器已經實現工業化。三種物理類傳感器即半導體型、熱電型和光纖型在最近幾年的研究研究比較迅速,本書將簡單介紹這些傳感器的工作原理。


一、半導體型氫氣傳感器
半導體型氫氣傳感器包括電阻型和非電阻型半導體傳感器。電阻型半導體傳感器主要以氧化錫、氧化鋅和氧化鎢等金屬氧化物作為氣體吸附材料制備成的金屬氧化物半導體氫氣傳感器。這類氫氣傳感器的工作原理是氫氣被金屬氧化物吸附後,氫氣被氧化釋放出電子,與吸附材料的氧原子結合,利用電化學分析原理通過檢測電流來檢測氫氣的濃度。半導體型氫氣傳感器主要的缺點是選擇性比較差,容易受到其他還原性氣體,如一氧化碳的干擾。現在有人利用納米技術通過提高傳感器的物理選擇性提高分析的選擇性,獲得比較明顯的效果,這對於將該技術用於在體氫氣濃度的檢測尤其重要。另外通過添加一定比例對氫氣選擇性好的金屬如鉑,可以提高敏感性和選擇性。
非電阻型半導體傳感器是通過檢測電容等非電阻電學量來檢測氫氣的濃度,有肖特基二極管型和金屬-氧化物-半導體型場效應管型兩類。在半導體材料上沉積一層金屬即可制得肖特基二極管型氫氣傳感器。該類型傳感器的檢測原理是,當肖特基二極管傳感器與氫氣接觸吸附後時,氫氣在催化金屬的表面分解為氫原子,氫原子向內擴散至金屬半導體界面處,在外加的偏置電壓下,界面電容隨外加電壓的變化而變化。這類傳感器最大的特點是可以在高溫下檢測氫氣的濃度。
半導體型氫氣傳感器結構簡單、易集成、易實現器件的小型化、使用壽命長,是一種比較理想的傳感器。但其工作溫度較高,增加了能耗和器件的尺寸,且在使用的過程中易產生電火花,在氫氣體積分數較高的環境下,易引起爆炸。


二、熱電型氫氣傳感器
熱電型氫氣傳感器的組成:首先在基片上沉積一層熱電材料,然後在熱電材料表面的某一部分沉積一層可催化氫氣的金屬(如鉑),最後分別在催化金屬層、熱電薄膜層引出電極,即獲得最為簡單的熱電型氫氣敏感元件。
當此敏感元件暴露在含氫氣的環境中,在催化金屬的作用下,氫氣與氧氣反應生成水蒸氣並放出熱量,於是沉積有催化金屬的一端溫度高,為熱端,無催化金屬的一端溫度低,為冷端,由於熱電材料的熱電發電效應,將這種熱端與冷端之間的溫差轉換為溫差電勢,以電信號的形式輸出,從而實現對氫氣的檢測。
熱電型氫氣傳感器具有兩大優點:一是不需要外加輔助電源,可以依靠熱電材料直接將溫差轉換為電信號;二是由於使用選擇性比較強的金屬,使氫氣的檢測選擇性比較強。


三、光纖型氫氣傳感器
光纖型氫氣傳感器有微鏡型傳感器和光纖光柵測縫型傳感器。固態氫氣傳感器一般是檢測電信號,一個共同的弊端就是可能產生電火花,對於氫氣濃度比較高的環境,這存在巨大的安全隱患。光纖傳感器使用光信號,所以,更適合於易爆炸的危險環境,光纖氫氣傳感器大都採用金屬鈀及鈀合金作為氫氣檢測材料,選擇性比較好。光纖氫傳感技術是測量薄膜透射率、反射率等物理參數改變實現對氫氣濃度的檢測。在具有光柵的光纖鍍一層金屬鈀膜即可得到光纖光柵測縫型氫氣敏感元件。當此元件放置在氫氛圍中,鈀吸收氫氣後形成鈀的氫化物,鈀膜結構發生形變,導致光柵波長變化,通過測量光柵波長變化檢測氫氣的濃度。
微鏡型氫氣傳感器是在光纖尾端鍍一層鈀或鈀合金膜,得到微反射鏡型光纖氫氣傳感器。當入射光經到達敏感元件,經敏感元件反射後經耦合器進入光檢測器。鈀膜吸氫後,薄膜反射率發生變化,於是引起光檢測信號變化,通過檢測接收端的光信號實現對氫氣濃度的檢測。這類傳感器原理簡單,目前發展的比較成熟。對氫氣濃度比較高的環境,採用這類檢測技術有比較強的可行性。
氫氣傳感器的選擇性、安全性、穩定性、靈敏度以及輸出信號弱等問題是限制氫氣傳感器應用的最主要原因,目前這些問題都逐漸得到解決,特別是在光纖傳感器、納米和新型敏感材料等方面的發展將不斷提高氫氣傳感器的技術。

第三節 溶液中氫氣含量的簡易檢測方法

使用氫氣過程中,無論是科研還是具體應用,準確測定氫氣濃度都是首先面對的重要問題,測定氫氣濃度的標準方法是氣相色譜法和電極法,但這兩種方法需要比較貴重的設備和複雜的檢測技術,不適合一些小型實驗室和普通用戶的需要。因此建立一種簡便準確的氫氣檢測方法十分必要。日本神奈川縣的MiZ公司專門從事研究開發用於健康的氫氣相關產品,最近他們建立了一種氫氣濃度檢測的簡易方法。

該公司的研究人員Bunpei Sato最近在《醫學氣體研究》雜誌上發表了該技術的介紹性文章,對他們開發的這種經濟實用簡便的測定溶液中氫氣含量的方法進行了介紹(該公司曾經開發了一種可以不打開包裝制備氫氣注射液的技術)。該方法屬於經典的氧化還原滴定法,其原理是通過膠體白金(納米絈)催化氫氣還原亞甲藍(methylene blue,MB)。亞甲藍是一種常用染料和氧化還原滴定指示劑(圖8-3)。


圖8-3 亞甲基藍和三水亞甲基藍分子結構式


曾經有一個非常著名的葡萄糖還原亞甲藍的科普實驗就是使用的該試劑。由於氫氣本身共價鍵的影響,氫氣難以和亞甲藍在常溫下發生反應,但在膠體白金催化下,則可以與等分子量氫氣發生氧化還原反應(圖8-4),反應可以使藍色的氧化型亞甲藍變成無色的還原型亞甲藍(leucomethylene blue, leucoMB)。其化學反應公式如下:




根據上述公式,這些作者使用氧化還原滴定體積分析法確定氫氣在水中的濃度


圖8-4:在金屬鉑催化下,1 mol氫氣和 1 mol亞甲藍反應產生1 mol還原型亞甲藍
(來自Seo T,et al. Med Gas RES,2012;2:1)




實驗方法
亞甲藍-珀試劑配置

亞甲藍購買自德國明斯特瓦爾德克公司Waldeck-Gmbh & Co KG,Munster。2%膠體鉑水溶液購買自Tanaka Kikinzoku Group Company。首先將亞甲藍0.3 g用98%乙醇(98.9 g)溶解為99.2 g亞甲藍乙醇溶液,然後將0.8 g膠體鉑水溶液和99.2 g亞甲藍乙醇溶液混勻成100 g亞甲藍膠體鉑MB-Pt試劑(MiZ Company,Kanagawa,Japan)。將上述MB-Pt試劑分裝到小塑料瓶,用吸管可從小塑料瓶中抽取(每滴17 mg或0.02 ml)。

氫氣水溶液的制備

氫氣飽和水(0.8 mmol/L)通過純水吹泡法制備,然後按照比例用純水稀釋成0.3、0.2和0.1 mmol/L 氫氣水溶液(不具體)。氫氣濃度使用電化學檢測,儀器使用model DHD1-1,DKK-TOA Corporation,Tokyo,Japan的電化學氣體傳感器。
氧化還原滴定法檢測氫氣含量,取氫氣溶液20 ml,然後用MB-Pt滴定以藍色消失為標準,直到藍色恰好不再繼續消失作為濃度計算的滴定法點(圖8-5)。


圖8-5:滴定結果圖示
自左向右,第一瓶為剛加入滴定液時情況,第二瓶為剛加入滴定液後的情況,第三全為加入滴定液10秒後的情況
(來自Seo T,et al. Med Gas Res,2012,2:1)


結果分析
1滴滴定液含為17 mg,當滴定液滴入氫氣溶液中,氫氣的摩爾數可以用亞甲藍表示,可用如下公式計算。
氫氣摩爾數=滴定液滴數×(17/1000) ×(0.3/100)/319.85
一滴滴定液17 mg含有0.16umol亞甲藍,20 ml飽和氫氣水(0.8 mmol/L)大約可消耗100滴滴定液(1.7g)(每毫升飽和氫氣水消耗5滴定液)。計算式如下:




儘管理論計算為100滴,但實際檢測後發現55滴就可以達到滴定點。(注:作者的解釋是在實驗過程中氫氣可以從溶液中發揮,但不可能在如此短時間揮發45%,這個似乎不可能,其實有一個可能就是氫氣的溶解度根本不是所謂的0.8 mmol/L,而可能是0.5 mmol/L。或者通氣的標準液沒有達到0.8 mmol/L,定標出錯的可能性是存在的。根據研究研果進行校對,作者認為每滴可以中和0.29umol氫氣(16/55)。也就是說每滴滴定液可以消耗20 ml氫氣溶液中氫氣的濃度為14.5umol(質量分數為0.03 mg/L或體積分數為3.0×10-10)。




分析結果可以發現,由於用於稀釋氫氣水的純水中含有氧氣,而氧氣把氫氣還原的亞甲藍氧化,也就是說會導致結果失真,採用氫氣飽和的水作為稀釋液,則結果更為穩定,更加符合預期結果。經過線性分析發現,儘管溶液中氧氣能產生一定干擾,但影響的比例比較小,不影響最終的檢測結果,因此這種方法可以作為電極檢測的替代方法。
當然這種滴定檢測方法也存在明顯缺陷。這種方法可用於純水或不含其他還原氧化成分的液體中氫氣濃度的檢測,但液體中如果含有其他氧化或還原性物質,則會干擾顯示的準確性,例如對血液和細胞培養液等不適合採用這種方法。從實用的角度,這種方法用於氫氣水的定性比較理想,用於定量則並不理想。


參考文獻

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第四節 利用氫氣的其他技術

除上述三類攝取氫氣的技術外,國際上氫分子生物學研究中也採用另外一些非經典技術。這些技術雖然使用比較少,但從理論上也直接或間接涉及氫氣的作用,故在這裡一並列舉。


一、局部利用氫氣的技術
局部利用氫氣的技術包括利用氫氣滴眼液,該技術曾經用於視網膜缺血的研究,通過反覆滴眼,證明對視網膜缺血再灌注損傷具有明顯的治療作用。儘管只有這一項研究,但該研究提示,使用氫氣滴眼液對眼科疾病具有潛在而廣泛的應用前景。


二、氫氣水皮膚塗抹和沐浴
由於氫氣的擴散能力非常強,氫氣淋浴可以作用經過皮膚攝取氫氣的手段,有學者曾經結合飲用和局部涂抹氫氣水治療皮膚炎症損傷,大部分在1~2周內獲得顯著的治療效果。除通過氫氣水局部使用外,身體局部攝取氣體的方法曾經用於二氧化碳的吸收。如果將身體局部甚至大部分密閉在氫氣環境中,依靠氫氣的巨大擴散能力,也可以作為一種使用氫氣的方法。不過目前這種方法尚未見報導。


三、氫氣注射
中山醫科大學黃國慶等對比腹腔注射氫氣和氫氣鹽水對全腦缺血的治療效果。由於氫氣在水中的溶解度比較低,直接注射氫氣可以獲得比同樣體積液體60倍以上的該氣體攝取量,因此從理論上這種注射方法可以大大提高其利用率。注射氫氣的缺點是可能引起注射部位的氣腫或感染,因此這種方法的安全性和有效性尚需更多研究。


四、誘導腸道細菌產生氫氣
口服人體小腸不吸收的藥物和食物,由於小腸不吸收,這些成分被運輸而大腸,可以使大腸內細菌吸收。大腸內有許多可以產生氫氣細菌,這些細菌利用這些能量物質製造大量氫氣。有學者曾經證明,口服阿卡波糖、變性淀粉、牛奶、姜黃素、乳果糖等可以促進體內氫氣的產生。另外具有促進大腸細菌產生氫氣的可能食物成分包括棉籽糖、乳糖、山梨糖醇、甘露醇、寡聚糖、可溶性纖維素等。誘導腸道細菌產生氫氣的方式產生的氫氣數量巨大,儘管有一部分氫氣可以被另外一些細菌,如甲烷細菌利用掉,但仍有許多可以被大腸黏膜吸收進入血液循環,並被運輸到其他器官發揮氫氣治療疾病的作用。這種手段已經有一些研究,但效果目前尚難以確定。


五、口服可以產生氫氣的藥物
金屬鎂曾經作為治療胃炎的藥物,其實口服金屬鎂粉,進入胃以後,金屬鎂在胃酸的作用下,迅速產生氫氣,這種方法是否可以達到利用氫氣治療疾病的目的,目前尚沒有實驗證據。有人開發出一種氫負離子的產品,所謂氫負離子,是指氫氣作為氧化劑和氧化某些金屬或非金屬的產物,例如氫化鎂、氫化鈣和氫化硅等,這些金屬或非金屬氫化物,具有非常活潑的化學性質,很容易和水發生反應。在使用過程中,只要這種物質與水接觸,會迅速發生反應並釋放出大量氫氣。因此,氫負離子的本質作用應該是氫氣。他汀類藥物可以抑制甲烷菌,而甲烷菌可利用氫氣生產甲烷,即抑制細菌代謝氫氣,從而間接增加腸道內氫氣含量。因此,推測腸道中氫氣含量的增加是這類藥物產生心臟保護作用的原因之一。


六、電針和直流電
電針的本質是直流電,在使用電針時,機體組織會被電極電解,在電針的正極,會由於失去電子發生氧化反應,水被電解會產生一定的氧氣,而由於組織液的成分複雜,在電針的正極非常容易產生各種活性氧。因此在電針過程中,正極可能會發生一定的氧化損傷。而在陰極,氫離子接受電子變成氫原子,氫原子結合成氫氣被組織攝取。有研究證明,直流電或電針可以使組織內氫氣的濃度升高。
電針療法儘管是從中醫理論出發開發出的現代中醫法療方法,許多人也開展了電針治療疾病機制的研究。由於電針可以造成組織內氫氣的濃度增加,不得不考慮氫氣在電針治療中的作用。許多研究證明,電針具有抗氧化和抗炎症作用,這恰好是氫氣被反覆證明的生物學效應。如果能證明電針治療疾病的作用是通過氫氣實現的,不僅對氫氣的研究有價值,而且對研究電針治療疾病的機制也提供了一種非常有說服力的解釋。


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